分泌性EVome在胰腺癌中快速和多面表征的作用:一种筛选推定生物标志物的全球组学方法

除了EVs表面的常规蛋白质外，该团队还想研究这些分泌颗粒内的蛋白质组。为此，他们收集了不同实验条件下的上清液KPC单独、PSC单独和共培养（CoC）。所有样品处理一式三分对EVs进行质谱分析。个体实验条件下的初步蛋白质组学分析从KPC细胞中提取721种蛋白质、从PSC细胞中提取400种蛋白质和CoC细胞中提取540种蛋白质。在被识别蛋白中，282个是KPC细胞特有的，65个是PSC细胞的，267个是在CoC细胞的，表明不同组的多样性为识别调节或反过来在直接双细胞肿瘤微环境（TME)中调节的候选蛋白质提供了环境。蛋白质上的磷酸化模式指示信号状态和活性，因此，该团队研究了在每种细胞条件下分泌的蛋白质的磷酸化蛋白质组。他们在 KPC 细胞系中鉴定出 489 个磷酸化蛋白，在PSC细胞中鉴定出 543 个，在CoC细胞中鉴定出 512 个。在这些蛋白质中特有的磷酸化蛋白质有250种，星状PSC中有34种，KPC细胞系中有130种。图1（v-vi）维恩分布表明在该研究中蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据集中检测到的 EVome 的可变性和独特性。

图 2(i)显示为多散点图，Pearson相关值为 0.7 到 1，表明从 KPC、PSC 和 CoC实验条件获得的数据之间存在良好的相关性。类似地，图 2(ii)在分析磷酸化蛋白时，在一式三分的条件下观察到 0.6-1 的相关值。LC-MS 数据的 PCA 图表明，一式三份在蛋白质 [图 2(iii)] 和磷酸化蛋白 [图 2(iv)] 之间紧密聚集。为了调查研究中确定的候选蛋白质和磷酸化蛋白之间的趋势，进行了无监督的层次聚类。复制品相互聚集，表明每种条件下的重现性良好。此外，图 2(v)他们在指示不同总蛋白表达趋势的蛋白质。图 2(vi)在具有五个簇的磷酸化蛋白中观察到更复杂的趋势。

从 KPC 细胞中鉴定的蛋白质的 GO 分析表明，它们大多富含信号受体和蛋白质结合分子功能（肌动蛋白、生长因子和酶）；细胞对有机物质、细胞因子和解剖结构的反应形态发生和发育生物学过程主要是细胞外、细胞表面或‎细胞外基质（‎ECM）的细胞成分定位。来自PSC细胞的囊外蛋白富含 ECM 结构分子或参与蛋白结合分子功能（SMAD、生长因子、PDGF 和 IGF）。常见的富集生物过程包括皮肤发育、细胞和生物粘附、细胞对刺激的反应和胶原蛋白组织。大多数蛋白质定位于ECM成分的一部分或参与胶原蛋白和晶状体三聚化。有趣的是，从CoC细胞中鉴定出的 540 种蛋白质富含生物学过程，这些生物学过程是细胞对有机或化学刺激的反应以及其他反应途径、涉及 SMAD、生长因子或 PDGF 的生物学功能绑定以赋予 ECM 拉伸强度。KPC 和 PSC 中观察到蛋白质细胞定位的相似性。对每组中鉴定的独特蛋白质进行 Reactome分析以更好地了解可以调节的途径。KPC 细胞中富集的重要途径是 TriC/CCT 伴侣蛋白的结合，其在生物合成过程中靶向蛋白质和微管蛋白折叠中间体的相关形成，折叠前介导的底物向 CCT/Tric 的转移，以及与β折叠 G-合作的蛋白质蛋白质复合物。富含 PSC 中鉴定的 65 种独特蛋白质的顶级 Reactome通路是调节横纹肌收缩的通路，ARMS-介导的激活、有缺陷的PGM1、因子XII和SERPING1 导致遗传性血管性水肿，以及胶原蛋白降解等。仅在CoC鉴定出的 267 种独特蛋白质富含调节胶原蛋白纤维和其他多聚体结构组装的途径，并且除了参与翻译后蛋白质磷酸化、胶原蛋白生物发生和降解以及ECM 重组外。在这三个条件下确定的蛋白质组是独一无二的，并有助于不同的 ECM 重塑能力。

使用原位脾脏注射 KPC 细胞的实验模型来确定肝脏转移是否增加。幼龄的 6-8 周 C57BL6 小鼠经眶后注射 5µg EVs以“培养”并在肝脏中生成 PMN。来自 KPC、PSC 和CoC条件的EVs 被注射到小鼠体内，持续25天。实验中还包括一个附加条件，该条件由KPC和PSC衍生的 EVs 以 1:9 的比例混合组成，以检查单个细胞 EVs池是否可以模拟CoC条件。这将提供有关体外条件下单独分泌的EVs是否足以诱导肿瘤转移增加的信息，或者是否正在产生独特的EVs群，仅当细胞相互相互作用时才能调节转移。培养期结束后，将KPC细胞原位植入小鼠脾脏，让肿瘤发育3周，随后处死小鼠。将肝脏的肿瘤重量与对照小鼠进行比较。实验设计示意图如图4（i）所示,与野生型小鼠相比，接受治疗的小鼠的肝脏重量均显著增加，但在不同组内没有显示出任何显著差异[图 4(ii)]。该实验重复了几次，发现来自KPC、PSC或CoC的EVs的组之间没有统计学意义的差别，肝脏重量的分布如图4(ii)所示，表明没有明显的趋势或变化。

为了研究在不同实验条件下接受 EVs 培养的小鼠肠道微生物组的早期变化，在两周培养结束时从小鼠身上收集粪便颗粒。从每组5只小鼠中收集粪便样本，分离DNA并进行微生物组富集和分析。图5(i)观察到不同的群体聚集在一起，表明每个实验组中的独特细菌富集，并提供额外的证据表明来自不同组的EVs对微生物组具有独特的影响。统计分析表明，不同的组，即 PBS、KPC、PSC和CoC彼此明显不同，差异具有统计学意义，所有组的测量q值<0.05。图5（ii）CoC微生物组的多样性水平显著低于其他微生物组（P<0.05),其他组之间没有统计学上的显著差异。有趣的是，每种培养条件下的EVs都选择性地准备好诱导小鼠微生物组的变化。LefSe（线性判别分析（LDA）分析在实验样品之间额外进行，以确定细菌分类群）不同类型的EVs对培养的差异化丰富。图5(iii)说明与PBS对照组相比，在PSC EVs下富集来自科里杆菌科 Adlercreutzia属的细菌培养。在KPC细胞的EVs培养的组中，来自Tenericutes门、Mogibacteriaceae、Adlercreutzia属的细菌非常丰富，而来自厚壁菌门、coprococcus 属的细菌在CoC样本中更丰富。图5（iv和v）表示门水平上的相对丰度的代表性条形图和热图，在KPC条件下，Tenericutes门（橙色条）更丰富。在CoC条件下,厚壁菌门更丰富。

该团队研究了来自癌细胞KPC或星状细胞PSC在独立和共培养条件下的EVs的贡献。共培养条件与PDAC的体内模型相同，其中癌细胞与基质细胞相互作用以产生促纤维增生反应和癌症进展。该策略是调查在EVs细胞群中观察到的早期变化是否有助于预测和识别TME重塑的新标志物。因此，该团队选择了在CoC下过度表达但在KPC和PSC下相对较低或下调的候选蛋白质。这可能归因于当癌细胞被特别调节的分子与基质细胞相互作用。他们确定了几个先前在文献中报道的与TME重塑有关的标志物，如纤连蛋白、Cxcl2、Cxcl1和 Ccl7。使用小鼠和人类正常和患病的胰腺、转移灶、不同阶段的KPC GEMM小鼠器官、胰腺癌的皮下和原位模型以及来自前面描述的EVs培养实验的肿瘤和转移灶，生成了混合TMA。图6选择生物标志物Kif5b、Sfrp2、Loxl2 和Mmp3进行验证。来自小鼠和人类正常和患病组织切片的代表性图像用组织学染色剂Masson's Trichrome对胰腺进行染色以验证组织形态学差异。对Kif5b、Sfrp2、Loxl2和Mmp3的后续切片进行额外染色，以研究正常和患病小鼠和人体组织中染色模式的差异。

图7和8说明Loxl2在正常胰腺腺泡中高表达，而在胰管中低表达，在间质中呈阴性。病变胰腺切片中的染色显示出Loxl2在小鼠肿瘤和基质中中度表达，而人胰腺在肿瘤中呈现低至中度表达，在基质中低表达。肝细胞和肺细胞染色弱或Loxl2表达阴性。肺、肝和腋窝转移瘤的肿瘤细胞中Loxl2表达较高。虽然研究人员在肺和腋窝转移瘤周围看不到基质，但肝转移中的基质显示弱染色。在小鼠和人类样本中观察到的转移中，Loxl2的表达水平也很高。此外，这强烈表明病变间质已被破坏，这可能增加相邻基质中的表达水平。还值得注意的是，基质染色存在明显差异，在病变组织和邻近正常组织的同一切片中，肿瘤周围的基质对标记物染色强烈，而邻近正常组织周围的基质没有染色，表明高度特异性小鼠和人类样品中的基质效应。这表明该表达是癌细胞直接暴露于基质的结果，并且是非常小的局部效应。就样本染色的一致性而言，大多数情况下染色模式不一致，从而限制了其作为进一步诊断目的的合适标记物的用途。

图7和8说明正常胰腺腺泡和导管对Kif5b染色强烈，而正常小鼠或人类样品中的基质染色较弱。肝细胞没有或弱染色，而肝导管显示高表达。正常情况下，肺泡和支气管也表现出过度表达。在小鼠胰腺中，该蛋白在肿瘤和基质中均高表达，而在人类胰腺中，蛋白质在肿瘤中的表达从低到高，在基质中的表达由低到负。肺、肝和腋窝转移瘤在肿瘤细胞中显示强阳性，而肝转移中的基质呈弱染色。图9对于不同年龄的KPC-GEMM小鼠，在25天、3和7个月时，肿瘤和基质中Kif5b的表达呈强阳性。正如前面用Loxl2观察到的，癌细胞和直接间质中的Kif5b染色显示出强阳性，而在正常胰腺中，腺泡呈强阳性，但相邻间质的蛋白表达呈弱阳性。图10在从KPC-GEMM小鼠分离的皮下培养的CTCs和DTCs中也观察到强染色，表明其可能是癌细胞分泌因子。Kif5b染色在小鼠和人类的样品类型中高度一致，并被检测为该研究中检测的所有标记中最强的染色标记。因此，Kif5b很可能是一种值得在胰腺癌中研究的可行的新标记物。

图7和8说明在混合TMA染色评估中，正常胰腺腺泡染色强烈，胰管染色弱，基质Mmp3染色阴性。肝管染色强烈，肝细胞Mmp3染色弱或阴性。在肺中，肺泡染色弱，而支气管蛋白质染色强阳性。Mmp3在小鼠和人胰腺中的肿瘤和基质中均低表达。在肺、肝和腋窝转移瘤中也观察到低表达。不同年龄的KPC GEMM也显示弱染色。图9中发现，唯一重要的趋势是病变胰腺中的强基质染色完全一致；尽管正常胰腺腺泡呈强染色，但周围基质的Mmp3呈阴性。相对于所有染色，Mmp3染色相对较弱，但远处转移除外。在小鼠和人类组织的混合TMA中，也观察到病变基质染色模式比正常腺泡周围的基质更为阳性。图10中DTCs和CTCs皮下植入物中也观察到弱染色。总之，该研究结果表明，Mmp3是一种弱染色标记物，且各样本的染色模式不一致，从而限制了其作为胰腺癌标记物的诊断价值。

图7和8说明正常小鼠和人胰腺腺泡和导管的Sfrp2染色强烈，而基质呈阴性。正常小鼠肝细胞和肝导管也呈强阳性，而人肝细胞和肝脏导管呈弱阳性。正常肺泡和支气管也呈强染色。在胰腺中，小鼠肿瘤和间质染色强烈，而人类肿瘤染色因间质细胞中的弱染色模式而变化。所有肺、肝和腋窝转移瘤在肿瘤细胞中均呈强阳性，而在肝转移中仅观察到基质细胞呈强阳性。图9在不同年龄的KPC-GEMM小鼠中，早期幼年小鼠的肿瘤和基质受到强烈拉伸。在小鼠和人类组织的混合TMA中也观察到了比正常腺泡周围的基质更积极的患病基质染色模式。图10在CTCs和DTCs中也观察到强阳性染色。与Kif5b一样，在小鼠和人类的不同组织中，Sfrp2显示出相似的一致染色模式。因此，该研究表明它是一种强染色标记物，可用于进一步的诊断目的。