总的来说，该团队在观察性研究和验证性研究中分别招募了71名和22名接受ICI治疗的MM患者。观察队列：表1总结了ICI治疗的患者特征和结果，其数据已在中报告，其中对相同系列的患者进行了筛查，以描述循环中的uPAR(Urokinase-type Plasminogen Activator Receptor)+ EVs。简而言之，该团队报告了29份回复(40.8%)，其中8份已完成。6个月以上的缓解率为46.5%(n=33)，缓解率为53.5%(n=38)。整个人群的中位PFS和中位OS分别为4个月和11个月。
图 1 EVs特性 ：A 从患者 1 的血浆中分离出的 EVs 的 TEM 图像（比例尺为 200nm）、DLS 图和 NTA 直方图，红色的置信区间报告了相同 EVs 的浓度和特定粒径。B 由 FCM 分析的响应者 (n = 38) 和非响应者 (n = 33) 中 CD9+ EVs、CD63+ EVs 和 CD81+ EVs 百分比的散点图。C 中位数散点图显示来自黑色素瘤细胞 (CD146+)、T 细胞 (CD8+) 和 B 细胞 (CD19+)、单核细胞 (CD14+) 和 DC (CD1a+) 的 EVs 百分比
对于ICI前的每个患者，该团队收集血液样本以获取血浆，通过超速离心法从血浆中分离EVs。通过TEM、DLS和NTA对EVs的大小和浓度进行表征。图1显示了患者1的EVs的特征，TEM显示EVs的大小约为100 nm，DLS的Z平均值为265±35 nm，PDI值为0.536，NTA显示80%以上的EVs的形态小于200 nm。在TEM分析的EVs尺寸略小于NTA测量的EVs尺寸，但值得注意的是，在TEM图像下EVs是干燥的，因此收缩。图1中的DLS和TEM代表了从血浆样本中恢复的所有EVs。因此，该团队一般使用术语EVs来表示小EVs的混合物，这些小EVs主要(>80%)由小于200 nm的EVs组成，与40-200 nm的外泌体相容。
用FCM检测四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81等三种外泌体/EVs标志物的阳性表达。报道了从应答者和无应答者血浆中分离到的CD9+、CD63+和CD81+ EVs(图2,1b)。通过评估四跨膜蛋白的双重和三重阳性，该团队为每个患者选择了至少三种四跨膜蛋白中的一种阳性的EVs。然后，该团队决定通过测量EVs对CD146、CD8、CD19、CD14和CD1a的阳性百分率，检测EVs的细胞来源(黑色素瘤细胞或免疫细胞，如T和B淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞)(图1C)。该团队的结果表明，不同来源(细胞类型)释放出相同数量的循环EVs。
3.应答者和无应答者血浆中PD-L1+EVs的检测
图2来自不同细胞类型的PD-L1+ EVs在黑色素瘤细胞和CD8+细胞来源的PD-L1+ EVs患者中通过治疗反应和PFS和OS的评估而聚集释放：A有反应者(n=38)和无反应者(n=33)PD-L1+ EVs百分比中位数的散点图(Mann Whitney t检验**p<0.01，*p<0.001)。B Kaplan-Meier生存曲线分析，根据PD-L1+EVs的四分位数，黑色素瘤和CD8 T细胞的PD-L1+EVs相对于PFS，C最佳应答的分布按来自黑色素瘤细胞的PD-L1+EVs的四分位进行分层。D Kaplan-Meier生存曲线分析根据PD-L1+ EVs的四分位数，黑色素瘤细胞的PD-L1+ EVs相对于OS。
从肿瘤细胞表达的 PD-L1 在抑制抗肿瘤免疫反应中的重要性开始 ，到对黑色素瘤患者的预后产生负面影响 ，并且由于文献结果表明 PD-L1+等离子中的EVs MM 患者的数量可能是 ICI 耐药性的生物标志物 ，该团队决定在开始 ICI 治疗之前研究从 MM 患者血浆中分离的 PD-L1+ EVs 及其同源 PD1+ EVs。众所周知，肿瘤分泌的外泌体在表面和外泌体颗粒中都含有 PD-L1，该团队初步评估了 EVs 的百分比，在表面表达 PD-L1，证明这些 EVs 在应答者中略高于在无反应者中。关注肿瘤和免疫细胞释放的 PD-L1+ EVs，该团队观察到只有来自黑色素瘤和 CD8+ T 细胞在统计学上导致应答者的水平低于无应答者（图 2A）。相对 Kaplan-Meier 生存曲线如图 2B 所示，D 和更高水平的黑色素瘤衍生 PD-L1+ EVs 与较差的 PFS (p < 0.0032) 和 OS (p < 0.00016) 相关，而仅来自 CD8+ T 细胞的 OS（p < 0.00016）。此外，总体反应率 (ORR) 分析证实了来自黑色素瘤的 PD-L1+ EVs 作为预测无反应者 ICI 耐药性的重要性（图 2C）。
图3 来自黑色素瘤细胞和免疫细胞的PD1+ EVs患者的PFS评估和多因素COX风险回归分析：A根据PD1+ EVs四分位数进行Kaplan-Meier生存曲线分析，这些EVs来自黑色素瘤细胞、CD8+ T细胞、B细胞、单核细胞和DC。B-PFS和C-OS的Cox分析，都执行了曲线的配对比较，并在每个图表旁边的表格中报告了p值。
在本研究的在无应答者和应答者中，有相当多的细胞释放更多的PD1+ EVs，这表明这些EV亚群有希望成为ICI反应的负面预测因素。因此，该团队根据PFS和OS的中位数将这些不同来源的EV水平进行关联，表明PFS水平较高与较差的PFS(p<0.0001)和OS(p<0.0001)密切相关，如图3A的PD1+EV四分位的Kaplan-Meier生存曲线所示。报告EV在应答者和无应答者中的百分比的点图分析和Kaplan-Meier生存曲线都表明，这些EV亚类可能代表ICI反应的新的生物标志物。因此，为了对独立的预测生物标志物进行严格的分析，该团队对OS和PFS进行了多变量COX风险回归分析(图3B/C)。对于PFS，CD8+ T细胞的PD1+ EVs和黑色素瘤的PD-L1+ EVs是与PFS相关的独立因素。更详细地说，来自CD8+ T细胞的PD1+ EVs和来自黑色素瘤的PD-L1+ EVs含量在第四个四分位数的患者出现较短的PFS的风险较高(分别为p=0.038和p=0.004)。相反，CD8+ T细胞的PD-L1+ EVs和单核细胞的uPAR+ EVs呈现相反的统计趋势(分别为p=0.069和p=0.07)。事实上，来自CD8+ T细胞的PD-L1+ EVs和来自单核细胞的uPAR+ EVs含量最高的患者发生进展性疾病的风险较小。因此，COX分析显示，在风险比和p值方面，作为负面因素的最显著变量是CD8+ T细胞的PD1+ EVs和黑色素瘤的PD-L1+ EVs的高含量(第四分位HR(95%CI)分别为22.351.18-422.53和41.83.28-532.71)。模型的预测性能为AUC=0.86，具有较强的预测价值。
所有这些分析证明，即使总的PD1+ EVs的释放不取决于患者的内在特征，如SEX、LDH、NLR、PLR，也不取决于肿瘤依赖的特征，如转移部位的数量、其他治疗的预处理和BRAF状态，证实PD1+ EVs可以被认为是对检查点抑制剂免疫治疗的先天抵抗的一般生物标志物。
5.循环肠道病毒作为免疫治疗耐药新生物标志物的评价
图4 循环EVs对免疫细胞向LND1球体渗透和杀伤的影响。LND1球体与应答者(RES)、非应答者(NRES)或健康供者(健康)的PBMC共培养概述，这些细胞是否与来自相同应答者或非应答者的循环EVs预先孵育。在共培养2 h(A)和24 h(B)后拍摄荧光显微镜照片。从健康供者、应答者和无应答者获得的PBMC预先孵育，不与REEV或NRES EVs一起培养，接种LND1球体，加入20µg/纳武利尤单抗。96h后，按M&M切片方法评价肿瘤细胞的活性。
下一步是对这些循环EVs进行评估，它们不仅作为预测ICI反应的生物标志物，而且还直接参与抗PD1药物耐药的机制。该团队推测，当在MM 3D细胞培养中加入纳武利尤单抗时，这些循环EVs可以减少无应答者的免疫细胞向肿瘤中的运输，并改变PBMC的细胞毒性。
为了评估免疫细胞向肿瘤的转运，该团队从LND1细胞(一种BRAF wt MM细胞系)中分离出三种不同群体的PBMC，分别从健康捐赠者的血液、反应者(RES)和无反应者(NRES)的血液中分离出来。所有PBMC预先与从RES和NRES的血浆中分离的循环EVs(红色染色)孵育1h，以模拟血流状况。在2 h和24 h后，该团队评估了PBMCs的转运(绿色染色)，如图4A所示，孵育2 h后，加入Res EVs增加了自体PBMCs对肿瘤的转运，而NRES EVs似乎略微减少了它们对肿瘤的接近。来自健康捐献者的PBMC显示出比来自MM患者的PBMC更大的转运肿瘤的能力；EVs的加入并没有改变他们的行为。循环中的EVs并不改变NRES PBMCs到达肿瘤的能力已经降低。24 h后，PBMC向肿瘤的转运更加明显；只有来自健康捐赠者的PBMC在添加REES EVs后显示减少；这在NRES EVs中更加明显(图4B)。
在纳武利尤单抗存在下，不同来源的PBMC对MM球体的杀伤作用的评估如图4C所示。96 h后，从MM患者血液中分离出的PBMCs(RES和NRES)经抗PD1抗体处理后，其杀伤活性提高了约2.4倍。循环EVs的加入并不改变存在和不存在纳武利尤单抗的Res PBMCs的细胞毒作用，而NRES PBMCs的细胞毒作用略有降低。当MM球体与来自健康供者的PBMC孵育时，细胞活力与患者PBMC的细胞活力相当，而加入纳武利尤单抗可显著降低细胞死亡率，在存在循环EVs的情况下，细胞死亡率降低，如果来自无应答者，则降低更多，证实循环EVs可能与抗PD1的耐药性直接相关。这些结果表明，多发性骨髓瘤患者的PBMC对抗PD1药物的反应天生就比健康捐赠者的低，而且来自多发性骨髓瘤患者的循环EV的加入降低了ICI疗效，主要是如果它们来自无反应者。为了调查患者PBMC的低反应性，该团队对它们进行了分析，观察到一个解冻步骤会减少所有PBMC的数量，就像该团队之前的分析一样。然而，MM患者和健康献血者的PBMC数量不同，患者中受影响的主要群体是：1)CD8 T细胞，总体和活化的T细胞；2)患者外周血中的DC，浆细胞样细胞(PDCs)和常规细胞(CDCs)均减少；M_2组的巨噬细胞总体减少，M_1组比M_1组更丰富，以及III)PMN-MDSC和M-MDSC作为T细胞，在应答者中比无应答者减少得更多，这与ICI在应答者中的更高疗效一致(图4D)。所有这些证据都证实了MM患者的PBMC活性低于健康献血者。
图5 PD1+ EVs结合纳武利尤单抗。有反应者(n=38)和无反应者(n=33)血浆中PD-L1+和PD1+ EVs百分比的中位数为散点图(Mann Whitney t检验**p<0.001)。将NRES1 EVs重新悬浮在1X PBS中并对PD1呈阳性的斑点图使用eBiosciences(Thermos Fisher)以绿色表示的商用抗PD1(CD279)，以及以蓝色表示的Fluo-nivolumab。使用商品化的绿色抗CD279和蓝色的氟尼伏单抗，将NRES1EV再悬浮在健康捐赠者的血浆中并呈PD1阳性的斑点图。
该团队发现MM患者血浆中PD-L1+EVs的百分率与PD1+EVs的百分率非常接近。因此测定了这些EVs在应答者和无应答者中的浓度，该团队观察到在应答者中PD-L1+EVs的水平显著高于PD1+EVs，而在非应答者中这两种EVs的数量是相似的(图5A)。这些结果提示，通过分析循环中的EVs与抗PD1的纳武利尤单抗结合，来评估PD1+EVs是否与抗PD1-药物的反应直接相关。用商品化的抗PD1抗体确定表达PD1的EV亚群的可能性表明这些EVs可以结合纳武利尤单抗。然而，该团队通过将抗PD1与荧光标记(flo-nivolumab)结合来确认这一点，并在与6 mm患者的循环EVs孵育后，该团队测量了PD1+EVs与荧光药物结合的百分比。这些实验是在DPBS和健康捐赠者的血浆中进行的，以模拟患者服用纳武利尤单抗的情况。在DPBS中，Fluo-nivolumab与循环EVs结合，与用于EVs表征的商用抗PD1抗体具有相同的效力；图5B无响应者#1(NRES1)的点图显示为代表所有对象。EVs与Fluo-nivolumab之间的相互作用表明，结合的效力在人体体液中也保持不变(图5C)。
7. 循环肠道病毒作为免疫治疗耐药的新生物标志物的验证
图6 PD-L1+ EVs和PD1+ EVs来自黑色素瘤和T细胞的响应者和非响应者，散点图，其中有从验证独立队列中分离的来自黑色素瘤的PD-L1+ EVs和来自CD8+ T细胞的PD1+ EVs的中位数（9）和非应答者（13）（曼·惠特尼t检验**p<0.05，***p<0.001）。根据PD-L1+ EVs四分位数，相对于PFS，根据PD1+ EVs的四分位数，相对于PFS进行生存曲线分析。C 单变量系数风险回归分析 （PFS）
如图3所示。3B/C组中，T细胞的PD1+ EVs和黑色素瘤的PD-L1+ EVs是最显著的负面影响因素，而对于OS，B细胞的PD1+ EVs是独立的阴性预后因素。该团队只验证了前两个独立的生物标志物，因为分析和采样之间的时间太短，没有达到观察性研究的中位数OS。验证是通过分析来自黑色素瘤的PD-L1+ EVs和来自T细胞的PD1+ EVs在9名应答者和13名非应答者血浆中的百分比来进行的。尽管到目前为止登记的患者数量很少，但统计分析显示，在无反应者中，EV的两个亚群的水平要高得多(图6A)，这与先前在观察性队列研究中显示的数据完全一致。来自黑色素瘤的PD-L1+ EVs的数据显示，来自T细胞的PD1+ EVs的统计能力保持不变，而它的统计能力下降(图2,6A)。Kaplan Meier分析表明，尽管样本量较小，但与PFS相关的两个独立因素仍保持着统计能力(图6B)。单变量分析证实了图6D中报告的结果。
